La fluorescence rouge en deux étapes

Tout a commencé par une observation faite il y a deux ans par des scientifiques de l'ETH avec une protéine fluorescente spéciale, la Dendra 2, isolée à partir de coraux. Elle émet une fluorescence verte. La lumière permet de modifier la structure moléculaire de la protéine de manière à ce qu'elle change de couleur et devienne rouge. Les chercheurs ont alors trouvé une deuxième voie, nouvelle, pour ce changement de couleur : on l'excite d'abord brièvement avec une impulsion laser bleue et on l'éclaire immédiatement après avec une lumière proche de l'infrarouge. Ce changement de couleur en deux étapes peut notamment être utilisé en microscopie à fluorescence pour rendre visible dans un tissu un point défini avec précision en trois dimensions, par exemple une seule cellule (Actualités ETH rapporté).

Une équipe internationale de chercheurs, dirigée par Periklis Pantazis, professeur au Département des systèmes biologiques de l'ETH Zurich à B?le, vient d'élucider ce mécanisme de changement de couleur en deux étapes. Les scientifiques l'appellent "primed conversion". Ces nouvelles connaissances permettent aux chercheurs de modifier d'autres protéines qui réagissent à la lumière de manière à ce qu'elles aussi puissent être excitées en deux étapes.

En l'espace de quelques millisecondes

Les chercheurs de l'ETH Zurich, de l'Institut de technologie de Karlsruhe et du Janelia Research 中国足球彩票 à Ashburn, Virginie, ont étudié de manière particulièrement précise les protéines activées par la lumière bleue. Ils ont ainsi pu montrer que ces protéines se trouvent dans un état d'excitation qui dure plusieurs millisecondes. "C'est relativement long", explique Pantazis, "d'autres phénomènes de fluorescence ont une durée plusieurs fois plus courte".

De même, les scientifiques ont pu montrer que cet état est un phénomène connu en chimie quantique, un état dit triplet. Après environ cinq millisecondes, la protéine colorée Dendra 2 revient à son état de base. La "conversion primée" ne se produit que si la deuxième étape, l'exposition à la lumière proche infrarouge, a lieu pendant la fenêtre temporelle du triplet.

Séquences d'acides aminés modifiées

La durée de vie de l'état triplet dépend fortement de la stabilité de la protéine colorée, et celle-ci dépend à son tour de la séquence exacte des éléments constitutifs de la protéine (les acides aminés). Les scientifiques ont donc modifié la séquence d'acides aminés de Dendra 2 à plusieurs endroits. Ils ont fait de même avec une autre protéine fluorescente, Eos, qui n'avait pas encore pu être excitée en deux étapes. La littérature scientifique indiquait que ces sites étaient centraux pour l'état triplet.

Pour toutes ces nouvelles protéines, les scientifiques ont mesuré la durée de l'état triplet. Pour certaines des protéines testées, cet état s'est prolongé de manière significative. Les scientifiques ont également réussi à modifier la protéine Eos de manière à ce qu'elle soit également activable en deux étapes. Ils ont réussi à faire de même avec six autres protéines qui n'étaient pas activables en deux temps jusqu'à présent. "Les protéines modifiées ne sont pas seulement activables pour la première fois en deux étapes, elles sont aussi plus stables et, par conséquent, plus lumineuses", explique Manuel Mohr, doctorant dans le groupe de Pantazis et premier auteur de l'étude.

Possible avec n'importe quel microscope

Les scientifiques ont fait leur découverte initiale avec un laser non commercial. Ils ont utilisé pour cela une lumière dans la zone proche de l'infrarouge. Mais entre-temps, les scientifiques ont pu montrer que l'effet était également obtenu avec des lasers rouges disponibles dans le commerce, comme ceux qui équipent tous les microscopes à fluorescence. En d'autres termes, la "conversion primed" est réalisable avec n'importe quel microscope à fluorescence.

"Primed conversion" peut être utilisé en microscopie pour marquer un point bien délimité dans un tissu. Pour ce faire, les scientifiques dirigent un rayon laser bleu et un rayon laser rouge dans le tissu de manière à ce que les rayons se croisent en un point. Ce n'est qu'à ce point de croisement que se produit la "conversion primée". "Comme ni la lumière laser bleue ni la lumière laser rouge n'ont d'effet toxique, cette méthode convient parfaitement aux organismes vivants", explique Pantazis. Selon lui, des applications dans d'autres techniques de microscopie sont également envisageables, notamment dans la microscopie à très haute résolution (super-resolution microscopy) qui existe depuis quelques années.

Cartographie du cerveau et séquen?age génétique

"Nous savons maintenant comment modifier les protéines photoconvertibles de manière à pouvoir les commuter en deux étapes", explique Pantazis. Les chercheurs ont fait breveter ce savoir. Les scientifiques de l'ETH collaborent avec des experts en protéines pour modifier en conséquence d'autres protéines colorées utilisées en microscopie.

Récemment, les scientifiques ont modifié des protéines de manière à ce qu'elles puissent faire cliver un neurotransmetteur activateur de gènes sous l'effet de la lumière, et ce de telle sorte que l'activation lumineuse puisse se faire avec deux couleurs. Les chercheurs pourraient irradier un tissu au laser de manière à ce qu'un rayon bleu et un rayon rouge se croisent en un point. Cela permettrait d'activer de manière ciblée des gènes dans une seule cellule du tissu. En outre, les protéines qui détectent le calcium peuvent également être modifiées en conséquence. Celles-ci pourraient être utilisées dans la cartographie 3D du cerveau.

Enfin, les biologistes peuvent utiliser la nouvelle technique pour d'autres analyses fonctionnelles en 3D : L'ETH Zurich a déjà accordé plusieurs licences pour ce brevet, dont une à une start-up qui souhaite développer le séquen?age de l'ADN dans un système 3D.